Развитие научных исследований на кафедре в последние годы связано с расшифровкой механизмов перестройки функциональных свойств транспортных систем плазматической мембраны и физиолого-биохимических процессов растительных клеток под влиянием экзогенных физико-химических стрессоров. При их действии происходит переключение обмена веществ клетки и растения в целом на новый режим. Для поддержания процессов жизнедеятельности клетки в нормальных и новых условиях среды необходимы взаимосвязанные системы регуляции, включающие генетическую, метаболическую и мембранную. Одной из компонент осуществления мембранной регуляции является изменение свойств транспортных систем плазматической мембраны.

Транспортные системы плазмалеммы обеспечивают неравновесное распределение электролитов и органических веществ по обе стороны мембраны, их поступление, поддержание оптимального внутриклеточного гомеостаза, рецепцию и трансдукцию экзогенных сигналов.

В основе указанных явлений лежит единый первичный рецепторно-конформационный принцип, который в самом общем виде состоит в следующем: взаимодействие белковой молекулы (рецептор) со специфическим эффектором приводит к изменению конфигурации рецептора и последующей передаче сигнала к внутриклеточным мишеням, обеспечивающим быстрый физиологический ответ. Одним из типов рецепторов, встроенных в плазматическую мембрану, являются белковые молекулы, образующие ионные каналы и другие транспортные системы. Экзогенный эффектор, вступая во взаимодействие с транспортными системами плазмалеммы, приводит к модификации их проводимости.

Основными транспортными системами на плазмалемме растительных клеток являются калиевые каналы, Н⁺-АТФазная помпа, система транспорта аммония и неселективные ионные каналы.

В зависимости от глубины модифицирующего мембранотропного действия экзогенных факторов изменяется характер и способность клетки и организма в целом адаптироваться к новым условиям.

В этой связи нами была поставлена цель: на основании изучения мембранотропного действия ряда экзогенных факторов (температура, различные виды пестицидов, одно- и поливалентные металлы, полисахариды) выявить возможные модификации транспортно-барьерных свойств плазмалеммы, их влияние на ионный состав, разработать приемы оценки их первичных эффектов и установить изменения в некоторых физиолого-биохимических показателях клетки.

Для осуществления поставленных целей был применены электрофизиологические приемы анализа механизмов воздействия исследуемых стимулов на транспортные системы переноса ионов через плазматическую мембрану растительной клетки, а также использовались радиоизотопные, фотометрические и биохимические методики.

В качестве объектов исследования использовались интернодальные клетки водоросли Nitella flexilis, микроводоросли Chlorella и проростки ячменя, выращенные в лабораторных условиях

Рассмотрим вкратце полученные нами за последние годы закономерности действия указанных стрессоров на транспортно-барьерные свойства плазмалеммы растительной клетки.

В результате анализа кратковременного и длительного воздействия повышенной (+32^оС) и пониженной (+4^оС) температур на клетку in vivo установлены механизмы термоиндуцируемой модификации свойств систем пассивного транспорта плазматической мембраны растительной клетки:

- кратковременное повышение температуры ведет к увеличению, тогда как ее снижение - к падению проводимости калиевых каналов. Для наружу- и внутрь выпрямляющих калиевых каналов наблюдается большее снижение входящего тока по сравнению с выходящим. Кратковременное снижение температуры индуцировало замедление, а резкое повышение - ускорение процессов активации и деактивации наружу выпрямляющих калиевых каналов плазматической мембраны;

- длительное воздействие гипотермии не оказывает существенного влияния на свойства калиевых каналов, в то время как в условиях гипертермии происходят значительное падение проводимости наружу- и внутрь выпрямляющих калиевых каналов плазмалеммы, степень которой зависела от времени воздействия. Отмечается снижение селективности внутрь выпрямляющих калиевых каналов;

- проводимость неселективных ионных каналов падала после кратковременного понижения температуры. Длительное воздействие гипертермии в течение 10 суток приводит к росту, а после 17 суток - к восстановлению проводимости к первоначальному уровню. Проводимость неселективных ионных каналов при гипотермии незначительно уменьшается и выходит на стационарный уровень к 10 суткам экспозиции;

- после 10-суточной экспозиции при повышенных и пониженных температурах наблюдается заметное уменьшение концентрации калия в цитоплазме с последующим ее восстановлением к 17 суткам.

Рецепция экзогенных химических соединений, в частности пестицидов, приводит к функциональным перестройкам ион-транспортных систем плазмалеммы, которые сводятся к следующим:

- пороговые концентрации, т.е. концентрации, вызывающие достоверные сдвиги транспортно-барьерных свойств мембраны, составляют для всех испытанных сим-триазиновых гербицидов и триазоловых фунгицидов 10^-6 - 5·10^-5 моль/л. Пиретроидные инсектициды оказывали действие в более низких концентрациях - 10^-7 моль/л.

- триазоловые фунгициды, сим-триазиновые гербициды и пиретроидные инсектициды характеризуются различной степенью мембранотропной активности, располагаясь по мере ее убывания в соответствующие ряды: пропиконазол тебуконазол ципроконазол; атразин симазин прометрин и эсфенфалерат дельтаметрин циперметрин;

- установленный рост коэффициента селективности альфа=Р_Na/P_K плазмалеммы под действием 8,4·10^-5 моль/л прометрина и 9,3·10^-5 моль/л атразина происходит в результате преимущественного снижения Р_К, а при 2,3·10^-5 моль/л атразина и 9,9·10^-5 моль/л симазина обусловлено увеличением P_Na. Обработка клеток симазином в концентрации 2,5·10^-5 моль/л, приводящая к уменьшению альфа, происходит главным образом за счет уменьшения P_Na. Сим-триазины проявляют более выраженное мембранотропное действие в форме неионизированных молекул. В присутствии тебуконазола, а также ципроконазола в концентрациях, не превышающих 10^-4 и 3·10^-4 М, соответственно, снижается проницаемость плазматической мембраны к ионам К⁺, а в случае ципроконазола и к ионам Na⁺. При экспозициях клеток в растворах, содержащих 3·10^-4 - 10^-3 моль/л Na⁺, пропиконазол индуцирует рост проницаемости плазмалеммы к ионам Na⁺ и, в меньшей степени, к ионам К⁺. Молекулы пропиканазола обладают способностью образовывать более стабильные, по сравнению с двумя другими испытанными триазолами, комплексы с ионами Na⁺ и К⁺ и, таким образом, выступают в роли ионофора. Пиретроидные инсектициды эсфенвалерат в концентрации 5·10^-5 моль/л и дельтаметрин вызывают преимущественное падение P_K и меньшее по величине увеличение P_Na, тогда как циперметрин - уменьшение обоих коэффициентов;

- наиболее значительные эффекты подавления функциональной активности калиевых каналов под действием фунгицидов отмечались в присутствии (1,5-3,0)·10^-4 моль/л ципроконазола, (3,5-7,0)·10^-5 моль/л тебуконазола и 10^-5 - 1,5·10^-5 моль/л пропиконазола. Сим-триазины в концентрациях (8,4-9,9)·10^-5 моль/л ингибируют функциональную активность К⁺-каналов, причем наиболее выраженным действием, особенно в отношении внутрь выпрямляющих каналов, обладают атразин и прометрин. Модификация сим-триазинами К⁺-каналов заключается в снижении их селективных свойств, которое проявляется в увеличении относительной проницаемости к одновалентным катионам Na⁺, Li⁺ и Cs⁺. Данный эффект, возможно, обусловлен механическим растяжением стенок канала за счет индуцированного сим-триазинами изменения гидрофобного взаимодействия с липидным окружением. Все испытанные инсектициды в концентрациях 5·10^-5 моль/л снижают проводимость наружу выпрямляющих К⁺-каналов; при действии эсфенвалерата также отмечается небольшое снижение, тогда как дельтаметрин и циперметрин практически не влияют на проводимость внутрь выпрямляющих каналов;

- развитие реакции плазмалеммы растительных клеток на присутствие в окружающей среде гербицидов и фунгицидов также обусловлено ростом проводимости неселективной ионной утечки;

- триазолы вызывают подавление функциональной активности светостимулируемой электрогенной Н⁺-АТФазной помпы плазмалеммы. Ввиду выраженных липофильных свойств молекул испытанных фунгицидов и гербицидов обнаруженное ингибирование, вероятно, осуществляется через изменение липидного микроокружения помпы. Сим-триазины оказывают в зависимости от концентрации и времени экспозиции разнонаправленное воздействие на функционирование фотоиндуцируемой Н⁺-АТФазной помпы и системы транспорта ионов NH4⁺. Наблюдаемые изменения активности Н⁺-помпы связаны со взаимодействием гербицидов с активным центром АТФазы на наружной стороне мембраны и изменениями электрического потенциала; ингибирование системы транспорта аммония, наоборот, происходит с цитоплазматической стороны плазмалеммы;

- из гербицидов более выраженным действием на транспортные системы плазмалеммы растительной клетки обладают хлорсодержащие сим-триазины (атразин, симазин) по сравнению с тиометилсодержащими (прометрин), а среди фунгицидов - дихлорсодержащее соединение (пропиконазол). Модификации ион-транспортных свойств плазматической мембраны клетки на действие фунгицидов обусловлены наличием и структурой липофильных заместителей в положении N-1 триазольного кольца, а активность испытанных сим-триазинов связана с наличием в их молекуле алкильных радикалов, причем изопропильные группы обладают большим мембранотропным эффектом по сравнению с этильными.

Из результатов, полученных в радиоизотопных экспериментах отметим следующие:

- накопление стронция в цитоплазме завершается после 5-6 часов выдерживания клеток Nitella и корней проростков в радиоактивном растворе;

- в контрольных условиях рост равновесного как калиевого потенциала (переход от полной среды Кнопа к среде Кнопа без калия), так и потенциала двухвалентных катионов (переход от раствора Кнопа к среде Кнопа без кальция и магния) повышает накопление катионов;

- ингибиторный анализ с верапамилом и нифедипином показал, что блокирование кальциевых каналов, т.е. переход проницаемости плазматической мембраны к неселективным каналам, вызывает значительное снижение стационарного уровня накопления стронция. При блокировании неселективных каналов накопление Sr либо не снижается (клетки корней проростков), либо возрастает (клетки Nitella).

Следовательно, изменение проницаемости мембраны, обусловленное функционированием того или иного механизма транспорта, влияет на накопление ионов в клетке. Полученные результаты, с одной стороны, указывают на высокую разрешающую способность используемых подходов для оценки рецепторных эффектов, приводящих к сдвигам барьерно-транспортных свойств плазматической мембраны под действием экзогенных стимулов, а, с другой, подчеркивают определенную общность механизмов поступления ионов в клетки различные тканей и органов.

Исследования в области биотехнологии, проводимые на кафедре, направленные на изучение индуцированных полисахаридами изменения ионного транспорта и физиолого-биохимических свойств иммобилизованных растительных клеток позволили установить следующие закономерности:

- показано, что включение клеток в Са-альгинатный гель повышает их жизненспособность по сравнению с иммобилизованными в агаре и свободными клетками при хранении в различных условиях освещенности и температуры;

- альгинатные гели активируют транспорт нитратов и снижают входящие потоки калия по сравнению с суспедированными клетками;

- мембранотропные эффекты отрицательно заряженных полисахаридов обусловлены взаимодействием с липидным бислоем и выражается в увеличении неселективной ионной проводимости плазматической мембраны;

- в процессе хранения отмечается изменение соотношения хлорофилла а и хлорофилла в. В наибольшей степени стабилизирующее влияние полисахаридных гелей сказывается на содержании хлорофилла а в клетках;

- иммобилизация растительных клеток в полисахаридных гелях (особенно в агаре) оказывает стабилизирующее действие на состояние фотосинтетических пигментов. За 60 суток хранения клеток в темноте при температуре 5^оС суммарное содержание хлорофиллов снизилось лишь на 5 %;

- установлено, что иммобилизованные в кальций-альгинатных гранулах клетки суспензионной культуры Syringa vulgaris характеризуются более высоким уровнем синтеза и экскреции фенольных соединений по сравнению со свободными клетками культуры.

В настоящее время научная деятельность кафедры охватывает широкий спектр разделов биологии, имеющих как фундаментальное, так и прикладное значение.

Клеточная биология и биофизика растений и животных:

• Исследование структуры и функции мембранных траспортеров, ионных каналов и рецепторов клеток растений и животных, систем сигнальной трансдукции, вторичных посредников, цитоскелета, клеточной стенки, запрограммированной клеточной гибели, автофагии и других систем растительной клетки.
• Развитие электрофизиологических методик, таких как пэтч-кламп, люминометрия, спектрофлуориметрия, флуоресцентная микроскопия, метод меченных атомов, количественный ПЦР-анализ.
• Развитие метода гетерологичной экспрессии генов ионных каналов растений в клетках человека (HEK 293) с их дальнейшим анализом при помощи техники пэтч-кламп.
• Развитие метода СОМЕТ для детекции повреждения ДНК у растений и животных.
• Изучение роли активных форм кислорода (АФК) в жизнедеятельности растительной клетки.
• Исследование механизмов окислительного стресса при помощи спектроскопии электронного парамагнитного резонанса.
• Анализ функций экзогенной L-аскорбиновой кислоты и антиоксидантной системы клетки.
• Установление механизмов перестройки фотосинтетического аппарата высших растений при тепловом стрессе, атаке патогенов и других воздействиях с использованием техники РАМ-флуориметрии (triple PAM).
• Установление механизмов ответа растительной клетки на стрессовые воздействия различной природы, в частности, тяжелых металлов, засоления, экстремальных температур и засухи.

Системная биология и биоинформатика растений:

• Создание платформ высокопроизводительного фенотипирования высших растений и водорослей.
• Разработка нейронных сетей для распознавания видов и сортов растений, а также их физиологического состояния и поражения патогенами.
• Разработка нейронных сетей для анализа морфологии клеток культур микроводорослей и поврежденных ядер растительных клеток (электрофорез одиночных ядер).
• Математическое моделирование биологических систем, анализ изображений растений.

Биотехнология и биоинженерия растений:

• Создание инновационных биотехнологий с использованием широкого спектра покрытосеменных растений, мхов и водорослей.
• Получение высокопроизводительных культур клеток, тканей и органов растений.
• Установление физиолого-биохимических механизмов, контролирующих процессы набора биомассы и биосинтеза биологически-активных веществ в культурах in vitro.
• Развитие биоинженерных подходов: микроклональное размножение растений, цифровое фенотипирование растений, создание компьютерных программ обработки феномной информации на основе систем машинного обучения, использование техники иммобилизации клеток, разработка инновационных продуктов для укоренения и дезинфекции древесных растений, корневой и черенковый прайминг, зеленый нанобиосинтез, использование наночастиц для стимуляции и контроля метаболических и ростовых процессов в культурах in vitro.

Разработка новых методических подходов:

• Разработка и усовершенствование электронных учебно-методических комплексов для преподавания дисциплин, связанных с клеточной и системной биологией растений, биоинженерией, биоинформатикой и физикой.