FAQ Поиск Пользователи Группы Профиль    
   РегистрацияРегистрация  Войти и проверить личные сообщенияВойти и проверить личные сообщения   ВходВход 

Неудавшийся эксперимент. Необходима помощь мол. биологов!!!
На страницу 1, 2  След.
 
Начать новую тему   Ответить на тему    Список форумов www.bio.bsu.by -> Обучение
Предыдущая тема :: Следующая тема  
Автор Сообщение
quercus

цитировать



Зарегистрирован: 02.10.2010
Сообщения: 4

СообщениеДобавлено: Sat Oct 02, 2010 7:46 pm    Заголовок сообщения: Неудавшийся эксперимент. Необходима помощь мол. биологов!!! Ответить с цитатой

В ходе спецпрактикума студентами кафедры молекулярной биологии был проведен эксперимент по выделению плазмидной ДНК. Выделение проводилось методом щелочного лизиса (Birmboim et Doly, 1979) с модификациями.

В качестве материала лаборантами кафедры была выдана ночная культура E. coli, содержащая плазмиду pUC18.

Культура была сконцентрирована центрифугированием (13000 rpm, 5’) несколько раз. Супернатант сливали, осадок ресуспензировали в 200 мкл буфера P1 (25 mM tris, 10 mM EDTA). Добавляли 400 мкл лизирующей смеси (0,2 М NaOH, 1% SDS). Спустя несколько минут (2-3) нейтрализовывали щелочь и высаливали белки 400 мкл кислого буфера (3M ацетат калия pH 4,8 ). Центрифугировали (13000 rpm, 10’), супернатант переносили в новую пробирку. Добавляли 0,7 объема 96% этилового спирта, оставляли на 20 минут в морозильной камере. Центрифугировали пробирку (13000 rpm, 10’). Высушивали осадок (сливали супернатант, отбирали остатки жидкости автоматической пипетки, помещали + 37С на 30 минут). Осадок растворяли в 100 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис, 0,1 мМ EDTA).

Полученные растворы анализировали электрофорезом в агарозном геле (неизвестного состава, происхождения и даты изготовления) без EtBr. В качестве электрофорезного буфера использовали 1X ТАЕ.

Готовили пробы: 2 мкл пробы, 8 мкл H2O, 2 мкл загрузочного буфера (0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксилолцианола, 40% сахароза в воде). В пробы дополнительно вносили по 1 мкл EtBr. Пробы загружали в лунки, парралельно вносили маркер молекулярных масс Gene Ruller 1kb DNA Ladder «Fermentas». Разделение проводили в течении 30 минут при напряженности электрического поля 5V/см.
Визуализировали, помещая гель на источник УФ свечения:


Первые 7 дорожек – пробы различных студентов, 8 дорожка (если хорошо присмотреться) МММ. На пробах 6 и 7 были видны слабо различимые полоски (между 1kb и 1,5 kb). Но в основной массе - денатурированная ДНК.
ГДЕ БЫЛА СОВЕРШЕНА ОШИБКА? У КОГО КАКИЕ ИДЕИ? ЗАРАНЕЕ СПАСИБО! Confused

Примечание:
* Повторив эксперимент с самостоятельно проверенной на селективной среде культурой и самостоятельно изготовленной агарозой, получили положительные результы.
* Данные растворы использовались уже имеющиеся: кислый буфер, TE, TAE.
* Данные расворы были изготовлены самостоятельно:
P1 (25 mM tris, 10 mM EDTA) V=10 ml
2,5 мл 0,1М трис
0,2 мл 0,5М EDTA
Вода до 10 мл.
Лизирующая смесь (0,2M NaOH, 1% SDS) V=10 мл
1 мл 10% SDS
0,4 мл 5М NaOH
Вода до 10 мл
Вернуться к началу
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail
Auto Pit Bot
Гость
цитировать






СообщениеДобавлено: Sat Oct 02, 2010 8:04 pm    Заголовок сообщения: 1 Ответить с цитатой

На мой взгляд ошибка в результате была в том что использованная в эксперименте нами агароза оказалась не качественной по причине давнего срока изготовления.
Вернуться к началу
Ment

цитировать



Зарегистрирован: 23.03.2007
Сообщения: 399
Откуда: Goettingen, Germany

СообщениеДобавлено: Mon Oct 04, 2010 10:44 am    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

На мой взгляд агароза + добавление EtBr напрямую в пробы. EtBr встраивается между нуклеотидами и меняет конформацию ДНК. Вносить слишком много его напрямую в пробу не есть хорошо, на мой взгляд. Это может объяснить, почему получились такие размытые бэнды. В эксперименте, который Вы проводили самостоятельно, Вы тоже добавляли EtBr в пробу, или в агарозу? Ещё один вариант - недостаточный лизис. Если был старый лизирующий буфер, то хромосомная ДНК не денатурировалась достаточно чтобы её потом убрать из расствора. На мой взгляд, лучше также увеличить время лизиса до 5 мин. Возможно, те бэнды, которые Вы видите около лунок - это как раз таки хромосомная ДНК.
_________________
Вот так!
Вернуться к началу
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение
А. Г. Птушкiн

цитировать



Зарегистрирован: 06.02.2009
Сообщения: 74
Откуда: duodecimus Juglans mandshurica sinistris

СообщениеДобавлено: Mon Oct 04, 2010 9:43 pm    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Ment прав по всем пунктам, а если хотите больше версий - уточняйте детали:
1. Клетки из какого исходного объема культуры лизировались указанным количеством реагентов?
2. Какая использована концентрация EtBr?
3. Какая использована концентрация агарозы?
4. Две размытые полоски лестницы, видные на фото - это 500 и 1000 н.п.?
_________________
A.Г. Птушкiн – праўдаруб, людавед і душалюб
Вернуться к началу
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение
Гость

цитировать






СообщениеДобавлено: Tue Oct 05, 2010 7:45 am    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Форез конечно красивый. Шмеры, явно кривые лунки. Если мне глазки не врут, ваши ДНКаки от лунок на пару мм отбежали. Электрофореза какие параметры? Времени сколько форезили? Раствор для лизиса делали непосредственно перед работой, или он болтался неизвестно сколько и неизвестно где?
Вернуться к началу
Гость

цитировать






СообщениеДобавлено: Tue Oct 05, 2010 7:48 am    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Упс, дядя Мент уже все написал... 8-(
Вернуться к началу
quercus

цитировать



Зарегистрирован: 02.10.2010
Сообщения: 4

СообщениеДобавлено: Tue Oct 05, 2010 10:09 pm    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Во второй раз EtBr добавляли только в агарозу. Агарозу готовили 1% (1г на 100 мл). Вносили 5 мкл EtBr. Концентрация EtBr 10 мкг/мкл.

Какого размера различимые фрагменты на МММ, честно говоря, не вспомню. Смею предположить, что 1000 и 3000 (они в норме самые яркие). К тому моменту, когда мы сфотографировали, все уже повыгарало. Но у нас на двух дорожках точно были полоски, расположенные относительно МММ между четвертой и пятой снизу (1000 и 1500).

Нам выдали 3 колбы по 10 мл ночной культуры на всех (во второй раз готовили самостоятельно). OD культуры мы не измеряли. Наливали в эпендорфы - центрифугировали - сливали супернатант - снова наливали. И так, пока колбочки не опустели. Осадок был... нормальный. Не большой,не маленький.

Лизирующий буфер готовили самостоятельно (написано в примечании), но нейтрализовали мы ,наверное, действительно слишком быстро. Во второй раз выдерживали подольше, и все получилось. Спасибо большое!
Вернуться к началу
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail
Microbotanist

цитировать



Зарегистрирован: 06.10.2010
Сообщения: 6
Откуда: г. Минск

СообщениеДобавлено: Wed Oct 06, 2010 10:57 pm    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Ment писал(а):
EtBr встраивается между нуклеотидами и меняет конформацию ДНК. Вносить слишком много его напрямую в пробу не есть хорошо, на мой взгляд.


На сколько сильно EtBr изменяет подвижность в геле при его добавлении прямо в лунку? Какое его количество целесообразно использовать в таких случаях? Если можно, то укажите ссылку на статью или какой-либо другой источник.
Вернуться к началу
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение
11
Гость
цитировать






СообщениеДобавлено: Sun Oct 10, 2010 8:13 pm    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Есть еще одно замечание.. насколько помню, 0,7 V добавляется в случае использования изопропанола, а в случае этанола нужно 2V...
хотя, возможно, это не столь значимо..
Вернуться к началу
Luciora

цитировать



Зарегистрирован: 31.08.2009
Сообщения: 21

СообщениеДобавлено: Mon Oct 11, 2010 11:28 pm    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Как любопытно!
И так много вариантов: взяли слишком много клеток, или плохо перемешали лизирующую смесь, не досушили после спирта, или плохо растворили осадок.
ИМХО передерживать на стадии лизиса не стоит (мне хватает 20-30'' ), т.к. вместо плазмиды получите деградировавшую ДНК.
И, главное, пишите, что и где у Вас ещё не получается, - это всем интересно! Smile
_________________
Я вставлю вам яичники обезьяны...
Вернуться к началу
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение
quercus

цитировать



Зарегистрирован: 02.10.2010
Сообщения: 4

СообщениеДобавлено: Tue Dec 14, 2010 11:16 pm    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Чтобы окончательно закрыть тему (и пропущенное занятие по БСП), выкладываю фотографию двухмесячной давности, доказывающую, что методикой выделения плазмидной ДНК мы овладели :

дорожки 1-9 - pUC18, 10 - 1kb DNA Ladder Fermentas

Всем спасибо
Вернуться к началу
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение Отправить e-mail
Zlobar
Гость
цитировать






СообщениеДобавлено: Wed Dec 15, 2010 12:21 am    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Вы наверное пошутили...
Не только не овладели, но даже слабо приблизились. Кафедру не позорьте.
Я бы посоветовал вашему преподавателю (кстати кто это?) для начала освоить с вами методику электрофореза в агарозном геле, а уж потом переходить к таким сложностям... Twisted Evil Twisted Evil Twisted Evil
Вернуться к началу
А. Г. Птушкiн

цитировать



Зарегистрирован: 06.02.2009
Сообщения: 74
Откуда: duodecimus Juglans mandshurica sinistris

СообщениеДобавлено: Wed Dec 15, 2010 10:50 am    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Эх, жалко, что дискуссия не в форуме для злобарей. А то точно написал бы что-нибудь эдакое:

Что стоишь, качаясь,
Под окошком, Quercus,
За которым ставят
Электрофорез?
Ты зайди, не бойся –
Может быть, научат
Методам очистки
Всяческих плазмид...

Twisted Evil
_________________
A.Г. Птушкiн – праўдаруб, людавед і душалюб
Вернуться к началу
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение
Microbotanist

цитировать



Зарегистрирован: 06.10.2010
Сообщения: 6
Откуда: г. Минск

СообщениеДобавлено: Thu Dec 16, 2010 12:35 pm    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Zlobar писал(а):
Я бы посоветовал вашему преподавателю (кстати кто это?) для начала освоить с вами методику электрофореза в агарозном геле, а уж потом переходить к таким сложностям... Twisted Evil Twisted Evil Twisted Evil


Преподаватель это Я. Было бы интересно услышать про освоение методики электрофореза. Если, конечно, есть конструктивные предложения, как это сделать в существующих условиях. Также меня интересовали бы и констатации по поводу методики электрофореза, что в данном случае с ней не так?

И еще вопрос про "позорить кафедру". Почему выставленный здесь форез позорит кафедру? Если я правильно понял пафос и эмоциональную нагрузку поста от Zlobar.
Вернуться к началу
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение
Luciora

цитировать



Зарегистрирован: 31.08.2009
Сообщения: 21

СообщениеДобавлено: Sat Dec 18, 2010 12:25 am    Заголовок сообщения: Ответить с цитатой

Плазмиды мало, а грязи много...
_________________
Я вставлю вам яичники обезьяны...
Вернуться к началу
Посмотреть профиль Отправить личное сообщение
Имя
Введите код Введите код "Четыре тысячи шестьсот двадцать один.
Сообщение

Смайлики
Very Happy Smile Sad Surprised
Shocked Confused Cool Laughing
Mad Razz Embarassed Crying or Very sad
Evil or Very Mad Twisted Evil Rolling Eyes Wink
Exclamation Question Idea Arrow
Дополнительные смайлики

 
Показать сообщения:   
Начать новую тему   Ответить на тему    Список форумов www.bio.bsu.by -> Обучение Часовой пояс: GMT + 2
На страницу 1, 2  След.
Страница 1 из 2

 
Перейти:  
Вы не можете начинать темы
Вы можете отвечать на сообщения
Вы не можете редактировать свои сообщения
Вы не можете удалять свои сообщения
Вы не можете голосовать в опросах




Powered by phpBB © 2001, 2002 phpBB Group
Русская поддержка phpBB