Научно-исследовательская работа

Исследования молекулярно-генетического направления связаны с изучением механизмов синтеза и генетической организации бактерий - продуцентов биологически активных соединений ароматической природы – аминокислот, антибиотиков и пигментов. В плане этой тематики проводятся новые приоритетные разработки по созданию систем генетического анализа ризосферных бактерий, конструированию плазмидных векторов для клонирования генов в клетках данных организмов, изучению биохимических путей синтеза антибиотиков и антибиотикоподобных веществ микробного происхождения и получению сверхпродуцентов с помощью генетических и генно-инженерных подходов. С 1996 г. на базе кафедры начаты новые разработки по изучению мутагенного и генотоксического действия используемых в сельском хозяйстве гербицидов и пестицидов.

Исследовательская работа в НИЛ цитогенетики растений при кафедре ведется под руководством B.C. Анохиной и связана с разработкой методов гаметной селекции растений на устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам, а также изучением генетических основ селекции зернобобовых культур и установлением роли различных генетических систем в формировании хозяйственно ценных признаков растений. В основе разрабатываемых проблем лежит почти 40-летний опыт работы лаборатории в области генетики и селекции растений. Результатом исследований в этом направлении явилось создание новых ценных для сельского хозяйства безалкалоидных форм люпина желтого, которые в настоящее время проходят испытания в производственных условиях. Изучен генетический контроль признака алкалоидности этой культуры и разработаны теоретические подходы получения новых ценных для сельского хозяйства форм. Создана генетическая коллекция двух видов люпина, которая может быть использована в качестве исходного материала для разного рода селекционных работ.

Сектор молекулярной генетики и биотехнологии микроорганизмов

В НИЛ молекулярной генетики и биотехнологии под руководством кандидата биологических наук Феклистовой И.Н. работает 8 штатных сотрудников, аспиранты и студенты старших курсов. Основными направлениями работ являются:

1. изучение биосинтеза ароматических соединений;
2. создание биопрепаратов для защиты растений;
3. изучение влияния ксенобиотиков на биосистемы.

Сотрудники лаборатории проводят исследования по следующим темам:

1. «Создание биопестицидного препарата комплексного действия на основе рекомбинантных бактерий Pseudomonas, пригодного для высокоактивной защиты растений от заболеваний бактериальной и грибной этиологии», выполняемого в рамках программы ГППИ «Новые биотехнологии», срок выполнения 2006 – 2010 гг. Номер 685/54. Научные руководители - зав. кафедрой генетики д.б.н. Максимова Н. П., декан биологического факультета В.В.Лысак.
2. «Разработать новый высокоактивный антиоксидантный препарат на основе флуоресцирующего пигмента пиовердина Рм микробного происхождения», выполняемой в рамках ГПОФИ «Физиологически активные вещества». Номер 660/54. Научный руководитель - зав. кафедрой генетики д.б.н. Максимова Н. П.
3. «Исследование зависимости устойчивости растительных организмов к действию абиотических стрессов от уровня экспрессии генов антиоксидантного комплекса», выполняемой в рамках программы ГКПНИ "Биологическая инженерия и биобезопасность", № госрегистраци 20063183, номер темы 651/54.
4. «Клонировать гены биосинтеза индол-3-уксусной кислоты у почвенных непатогенных бактерий Pseudomonas и изучить их экспрессию в гомо- и гетерологичных системах», выполняемой в соответствии с государственной научно-технической программой «Генетическая инженерия» с 2004 по 2006 гг. Номер темы № 134/55. Номер госрегистрации 20031376. Научный руководитель - зав. кафедрой генетики д.б.н. Максимова Н. П.
5. «Разработать подходы и осуществить конструирование новых штаммов-продуцентов антибиотиков широкого спектра действия на основе бактерий и создать новые эффективные средства защиты растений от заболеваний различной этиологии», выполняемой в соответствии с государственной научно-технической программой «Генетическая инженерия» с 2004 по 2006 гг. Номер темы № 133/55П. Номер госрегистрации 2031377. Научные руководители - зав. кафедрой генетики профессор Максимова Н. П., декан биологического факультета В.В.Лысак.
6. «Создать микробные сверхпродуценты ароматических аминокислот L-триптофана, L-фенилаланина, L-гистидина», выполняемой в соответствии с государственной научно-технической программой «Аминокислоты» с 2004 по 2006 гг. Номер темы № 185/55. Научный руководитель - зав. кафедрой генетики, д.б.н. Максимова Н. П.

Руководителем большинства из них является заведующая кафедрой генетики, доктор биологических наук, профессор Максимова Наталья Павловна.

Сектор генетики растений

В НИЛ молекулярной генетики и биотехнологии сектор генетики растений работают : руководитель – доцент, кандидат биологических наук Анохина В.С., Саук И.Б., Романчук И.Ю., Карпиевич В.В.

Направления исследований:

• Частная генетика растений
• Гаметная селекция
• Индивидуальное развитие растений
• Коллекции люпина желтого и узколистного по качественным и количественным признакам
• Биохимия растений
• Молекулярное маркирование

Темы текущих исследований:

1. Создать признаковую коллекцию и банк данных генофонда культивируемых видов зернобобовых культур, разработать рекомендацию по поддержанию, размножению и практическому использованию коллекционного материала.
2. Разработать комплексный метод морфогенетической и биохимической оценки устойчивости селекционных образцов люпина узколистного к фузариозу.
3. Изучить генофонд культивируемых видов люпина по устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам и разработать морфогенетические критерии диагностики перспективных для селекции генотипов.
4. Генетические системы адаптации растений и их роль в продуктивности и устойчивости к биотическим и абиотическим факторам.

Сектор генетики растений активно сотрудничает с НАРБ, БелНИИЗиС, БелНИИО, ВНИСОК, институтом генетики ПАН, ВИР, ВНИИ люпина, ВНИИЗиК, ТСХА, БрГОСХОС.

Доцент кафедры Анохина В.С. имеет тесные контакты с научно-исследовательскими институтами генетико-селекционного профиля России: Всероссийским Институтом люпина (г. Брянск), Всероссийским научно-исследовательским институтом сельского хозяйства нечерноземной зоны (Москва, Немчиновка), а также с БГСХА г.Горки, с РУП «Брестская областная сельскохозяйственная станция НАН Беларуси. Совместно с Московским НИИСХ «Немчиновка» и НИЛ молекулярной генетики и биотехнологии (сектор генетики растений) выполнялся совместный договор, который включает финансовые обязательства, совместные публикации.

Сектор молекулярной генетики человека

Текущие задачи решаемые группой.

Фундаментальные исследования:

• Роль гибридного гена aml1/eto в поддержании t(8;21)(q22;q22)-положительной формы острого миелоидного лейкоза человека.
• Соотношение между кумулятивным риском t(8;21)(q22;q22)-положительной формы острого миелоидного лейкоза и частотой функциональной транслокации t(8;21)(q22;q22) в популяциях людей.
• Разнообразие РНК-транскриптов гибридного гена aml1/eto и их функциональная роль.

Ориентированные фундаментальные исследования:

• Направленная генетическая модификация стволовых клеток человека с помощью лентивирусных векторов доставки.
• Создание сурогатных инсулин-продуцирующих клеток путем генетической модификации мезенхимальных стволовых клеток (МСК)человека.
• Наследственная предрасположенность к сахарному диабету I и II типа.

Фундаментальные исследования. Функциональная роль гибридного гена aml1/eto при t(8;21)(q22;q22)-позитивной форме острого миелоидного лейкоза человека.

ЧАСТЬ I. Разработка систем конститутивной и индуцибельной РНК интерференции для контроля экспрессии гибридного гена aml1/eto.

Сбалансированная транслокация t(8;21)(q22;q22) между хромосомами 8 и 21, встречаясь с частотой ~16% среди всех de novo зарегистрированных случаев острого миелоидного лейкоза, относится к наиболее распространенным генетическим нарушением, детектируемым при этом заболевании. В результате транслокации происходит объединение гена eto, который локализован на хромосоме 8, с геном aml1, находящимся на 21 хромосоме, в единый гибридный ген aml1/eto на деривате хромосомы 8. Этот ген кодирует химерный белок AML1/ETO, который, по-видимому, и играет ключевую роль в инициации t(8;21)(q22;q22)-позитивной формы острого миелоидного лейкоза. Однако при этом было установлено, что сам по себе гибридный ген aml1/eto не способен вызвать лейкоз, выяснено, что для этого нужны дополнительные (вторичные) мутации. Более того, играет ли этот ген какую-то роль в последующей прогрессии заболевания остается неизвестным. Неопределенность же роли гена aml1/eto в прогрессии лейкоза не позволяет рассматривать сам ген или его продукты (РНК или белок) как потенциальную мишень в разработке новых селективных ингибиторов для терапии острого миелоидного лейкоза.

С этой целью группой была спроектирована, создана и экспериментально проверена целая серия экспрессионных кассет, обеспечивающих конститутивную или индуцибельную наработку aml1/eto-специфических искусственных микроРНК или коротких шпилечных РНК в клетках модельных линий Kasumi-1 и SKNO-1 t(8;21)(q22;q22)-положительного острого миелоидного лейкоза человека. Перенос таких экспрессионных кассет в лейкозные клетки осуществляется с помощью рекомбинантных лентивирусов, псевдотипированных гликопротеином вируса везикулярного стоматита, получаемых путем котрансфекции клеток линии 293Т эмбриональной почки человека смесью из трех векторов: вектора упаковки pCMV_dR8.91, вектора оболочки pMD2.G и соответствующего лентивирусного вектора доставки.

Полученные группой результаты указывают на высокую эффективность и специфичность РНК интерференции, запускаемой искусственными микроРНК или короткими шпилечными РНК, в отношении гибридного гена aml1/eto. Эти результаты являются основанием для начала работ по изучению функциональной роли гибридного гена aml1/eto в поддержании t(8;21)(q22;q22)-положительной формы острого миелоидного лейкоза человека на моделях in vivo.

Исследования функциональной роли гибридного гена aml1/eto при t(8;21)(q22;q22)-позитивной форме острого миелоидного лейкоза человека проводятся в тесной кооперации с группой по изучению гибридных генов из Северного научно-исследовательского института рака при университете г. Ньюкасл, Великобритания.

Эффективность “нокдауна” белка AML1/ETO, индуцированного анти-aml1/eto короткими шпилечными РНК (А) илианти-aml1/eto искусственными микроРНК (Б).

Ориентированные фундаментальные исследования. Костномозговые мезенхимальные стволовые клетки как инструмент доставки ex vivo терапевтических генов человека.

МСК относительно легко выделяются из различных тканей и органов человека, включая костный мозг, пуповинную кровь, плаценту, легкие и жировую ткань. Изолированные и наращенные в условиях in vitro они сохраняют при этом ряд своих уникальных свойств, в частности, способность к самообновлению и к дифференцировке (в контролируемых in vitro условиях, мимикрирующих ситуацию in vivo) в остеобласты, хондробласты, адипоциты, миобласты, кардиомиоциты, гепатоциты и нервные клетки. Кроме того, МСК могут быть стабильно модифицированы терапевтическими генами, реимплантированы назад в организм человека и, благодаря хоминг-эффекту, они способны колонизовать специфические типы тканей, обеспечивая их регенерацию или оказывая терапевтический эффект. Таким образом, МСК являются привлекательным и многообещающим инструментом регенеративной медицины, а также способом системной доставки терапевтических генов ex vivo.

Для оценки эффективности и стабильности генетической модификации костномозговых МСК человека сопряженной парой генов мы разработали новый бицистронный лентивирусный вектор доставки pHR-CMV-DRep, кодирующий два репортерных трансгена – красный флуоресцирующий белок DsRed1 и белок eGFP с усиленный зеленой флуоресценцией.

Согласно результатам проведенных нами исследований, МСК могут быть эффективно модифицированы двумя трансгенами, переносимыми в составе одного лентивирусного вектора доставки. При использовании в качестве внутреннего регуляторного элемента промотора PCMV ранних генов цитомегаловируса человека такая модификация является стабильной на протяжении, по меньшей мере, одного месяца культивирования стволовых клеток in vitro. Кроме того, МСК разных пассажей сохраняют одинаковую чувствительность к трансдукции бицистронным лентивирусным вектором.

Нами было показано, что генетически модифицированные клетки сохраняют гепатогенный потенциал дифференцировки и в гепатогенных условиях не только дифференцируются в гепатоцитоподобные клетки, но и поддерживают экспрессию трансгенов на более высоком уровне, чем клетки, культивируемые в негепатогенных условиях.

Наши результаты дают основу для дальнейшего развития подходов направленной генетической модификации костномозговых МСК человека множеством генов в исследовательских и терапевтических целях.

Исследования проблем генетической модификации стволовых клеток человека проводятся в тесной кооперации с Лабораторией биологии и генетики стволовых клеток Республиканского научно-практического центра гематологии и трансфузиологии, г. Минск, Беларусь.